2 × Pfu PCR Mix

Template A-1

■ U mudellu cuntene impurità di proteine ​​o inibitori di Taq, ecc. - Purificà u mudellu di DNA, elimina impurità di proteine ​​o estratta DNA di mudellu cù kit di purificazione.

■ A denaturazione di u mudellu ùn hè micca cumpleta -—Aumentà adeguatamente a temperatura di denaturazione è allungà u tempu di denaturazione.

■ Degradazione di u mudellu ——Riprepara u mudellu.

A-2 Primer

■ Scarsa qualità di primure -—Risintetizza a primura.

■ Primer degradation ——Aliquot the primers high concentration in small volume for preservation. Evite parechje congelazioni è scongelamenti o criopreservati à longu andà à 4 ° C.

■ Cuncepimentu impropriu di primer (per esempiu, a lunghezza di primer ùn hè micca sufficiente, dimer furmatu trà primer, ecc.) -Primers di redisignazione (evità a furmazione di dimeri di primu è di struttura secondaria)

A-3 Mg²⁺cuncentrazione

■ Mg²⁺ a cuncintrazione hè troppu bassa - -Aumenta propiu Mg²⁺ cuncintrazioni: Ottimizà u Mg²⁺ concentrazione da una seria di reazzioni da 1 mM à 3 mM cun un intervallu di 0,5 mM per determinà u Mg ottimale²⁺ cuncentrazione per ogni mudellu è primer.

A-4 Temperatura di ricottura

■ L'alta temperatura di ricottura influenza u ligame di u primer è di u mudellu. ——Riduce a temperatura di ricottura è ottimisate a cundizione cun un gradiente di 2 ° C.

A-5 Tempu di prulungazione

■ Tempu di prulungazione cortu —— Aumenta u tempu di prulungazione.

Fenomeni: I campioni negativi mostranu ancu e bande di sequenza target.

A-1 Cuntaminazione di PCR

■ Cuntaminazione incrociata di a sequenza di destinazione o di i prudutti di amplificazione - Ùn fate micca pipetta cù u campionu chì cuntene a sequenza di destinazione in u campione negativu o sparghjeli fora di u tubu di centrifuga. I reagenti o l'attrezzatura devenu esse autoclavati per eliminà l'acidi nucleici esistenti, è l'esistenza di contaminazione deve esse determinata per mezu di esperimenti di cuntrollu negativu.

■ Cuntaminazione di i reagenti ——Aliquot the reagents and store at low temperature.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ a cuncintrazione hè troppu bassa - -Aumenta propiu Mg²⁺ cuncintrazioni: Ottimizà u Mg²⁺ concentrazione da una seria di reazzioni da 1 mM à 3 mM cun un intervallu di 0,5 mM per determinà u Mg ottimale²⁺ cuncentrazione per ogni mudellu è primer.

■ Cuncepimentu impropriu di prima, è a sequenza di destinazione hà omulugia cù a sequenza micca di destinazione. —— Primarii di cuncepimentu di novu.

Fenomeni: E bande d'amplificazione PCR sò incoerenti cù a dimensione prevista, sia grande sia chjuca, o qualchì volta si verificanu sia bande d'amplificazione specifiche sia bande d'amplificazione non specifiche.

A-1 Primer

■ Scarsa specificità di primu

—— Primariu di cuncepimentu di novu.

■ A cuncintrazione di prima hè troppu alta - Aumenta propiu a temperatura di denaturazione è prolunga u tempu di denaturazione.

A-2 Mg²⁺ cuncentrazione

■ U Mg²⁺ a cuncintrazione hè troppu alta - Riduce propiu a concentrazione Mg2 +: Ottimizà u Mg²⁺ concentrazione da una seria di reazzioni da 1 mM à 3 mM cun un intervallu di 0,5 mM per determinà u Mg ottimale²⁺ cuncentrazione per ogni mudellu è primer.

A-3 Polimerasi termostabile

■ Quantità eccessiva di enzimi ——Riduce a quantità di enzimi adeguatamente à intervalli di 0,5 U.

A-4 Temperatura di ricottura

■ A temperatura di ricottura hè troppu bassa - Aumenta in modo adeguatu a temperatura di ricottura o adopra u metudu di ricottura in duie tappe

A-5 cicli di PCR

■ Troppu cicli di PCR -—Riduce u numeru di cicli di PCR.

A-1 Primer——Povira specificità ——Risignate u primer, cambiate a pusizione è a lunghezza di u primer per migliurà a so specificità; o eseguite PCR nidificata.

A-2 Template DNA

——U mudellu ùn hè micca puru ——Purificà u mudellu o estratti DNA cù kit di purificazione.

A-3 Mg²⁺ cuncentrazione

——Mg²⁺ a cuncintrazione hè troppu alta - Riduce propiu Mg²⁺ cuncintrazioni: Ottimizà u Mg²⁺ concentrazione da una seria di reazzioni da 1 mM à 3 mM cun un intervallu di 0,5 mM per determinà u Mg ottimale²⁺ cuncentrazione per ogni mudellu è primer.

A-4 dNTP

——A cuncintrazione di dNTP hè troppu alta ——Riduce a cuncentrazione di dNTP in modu adattu

A-5 Temperatura di ricottura

——Temperatura di bassa ricottura ——Aumentà adeguatamente a temperatura di ricuitura

Cicli A-6

—— Troppu cicli ——Optimize u numeru di ciclu

U primu passu hè di sceglie a polimerasa adatta. A polimerasi regulare Taq ùn pò micca ripruduce a causa di a mancanza di attività di esonucleasi 3'-5 ', è u disaccordu riduce notevolmente l'efficienza di l'estensione di i frammenti. Dunque, a polimerasi Taq regulare ùn pò micca amplificà efficacemente frammenti di destinazione più grandi di 5 kb. A polimerasa Taq cun mudificazione speciale o altra polimerasa ad alta fideltà deve esse scelta per migliurà l'efficienza di l'estensione è risponde à i bisogni di amplificazione di frammenti lunghi. Inoltre, l'amplificazione di frammenti lunghi richiede ancu un adattamentu currispundente di cuncezzione di primer, tempu di denaturazione, tempu di estensione, pH tampone, ecc. Per prevene i danni à u mudellu, u tempu di denaturazione à 94 ° C deve esse riduttu à 30 sec o menu per ciclu, è u tempu per elevà a temperatura à 94 ° C prima di l'amplificazione deve esse menu di 1 min. Inoltre, impostà a temperatura di estensione à circa 68 ° C è cuncepisce u tempu di estensione secondu a frequenza di 1 kb / min pò assicurà una amplificazione efficace di frammenti lunghi.

U tassu di errore di l'amplificazione PCR pò esse riduttu aduprendu diverse polimerasi di DNA cù alta fedeltà. Frà tutte e polimerasi di DNA Taq truvate fin'à avà, l'enzima Pfu hà u più bassu tassu d'errore è a più alta fideltà (vede a tola aghjunta). Oltre à a selezzione di l'enzimi, i ricercatori ponu riduce ulteriormente a velocità di mutazione PCR ottimizendu e cundizioni di reazione, cumprese l'ottimisazione di a cumpusizione tampone, a concentrazione di polimerasi termostabile è l'ottimisazione di u numeru di ciclu PCR.