Type: Spin based in colonna
Campione: Plasma, siero, fluidi corporei senza cellule, ecc.
Ughjettivu: Virus RNA.
Volume di partenza: ~ 140 μl
Tempu di operazione: ~ 1 ora
Applicazioni downstream: RT-PCR / RT-qPCR, custruzzione di libreria NGS, reazzioni enzimatiche, ecc.
A-1 Bassa concentrazione di cellule o virus nel campione di partenza
- Arricchisce a concentrazione di cellule o virus.
A-2 Lisi insufficiente di i campioni
—I campioni ùn sò micca stati mischiati bè cù u buffer di lisi. Hè suggeritu di mischjà accuratamente per impulsu-vortexing per 1-2 volte.
-Lisi cellulare insufficiente causata da a diminuzione di l'attività di a proteinasi K.
-Lisi cellulare insufficiente o degradazione di e proteine per via di un tempu di bagnu caldu insufficiente. Hè suggeritu di taglià u tissutu in picculi pezzi è allargà u tempu di bagnu per eliminà tutti i residui in u lisatu.
A-3 Assorbimentu di DNA insufficiente.
-Nisun etanolu o bassa percentuale invece di 100% etanolu hè statu aghjuntu prima chì u lisatu sia trasferitu à a colonna di spin.
A-4 U valore di pH di u tampone d'eluzione hè troppu bassu.
-Aghjusteghja u pH trà 8,0-8,3.
Etanolu residuale in l'eluente.
-Ci hè un tampone di lavatu residuale PW in l'eluente. L'etanolu pò esse eliminatu centrifugendu a colonna di spin per 3-5 min, è dopu piazzendu à temperatura ambiente o incubatrice da 50 for per 1-2 min.
A-1 U campionu ùn hè micca frescu.
-Estratti un campione d'ADN pusitivu cum'è cuntrollu per determinà se l'ADN in u campione hè degradatu.
A-2 Pre-trattamentu impropriu.
-Causatu da una macinazione eccessiva di azotu liquidu, da u recuperu di l'umidità, o da una quantità troppu grande di u campione.
I pretrattamenti devenu variare per campioni sfarenti. Per i campioni di piante, assicuratevi di macinà bè in azotu liquidu. Per campioni d'animali, omogeneizà o macinà bè in azotu liquidu. Per i campioni cù pareti cellulari chì sò difficiuli à rompe, cume i batteri G + è u lievitu, si suggerisce di aduprà lisozima, liticasi o metudi meccanichi per rompe i muri cellulari.
4992201/4992202 U Kit di DNA Genomicu vegetale adotta un metudu basatu in colonna chì richiede cloroformu per l'estrazione. Hè particolarmente adattatu per vari campioni di piante, è ancu per a polvere secca di e piante. Hi-DNAsecure Plant Kit hè ancu basatu in colonna, ma senza bisognu di estrazione di fenol / cloroformu, rendendulu sicuru è micca tossicu. Hè adatta à e piante cù un altu cuntenutu di polisaccaridi è polifenoli. 4992709/4992710 DNAquick Plant System adotta un metudu à basa di liquidu. L'estrazione di fenol / cloroformu ùn hè micca necessaria ancu. A procedura di purificazione hè simplice è rapida senza limite per i campioni di iniziali, cusì l'utenti ponu adattà a quantità in modo flessibile secondu i requisiti sperimentali. Grande taglia di frammenti di gDNA pò esse ottenuta cun elevatu rendimentu.
U DNA genomicu hè statu estrattu da diversi volumi di campioni di sangue interu umanu da u Kit di DNA di sangue TIANamp. I risultati sò i seguenti. I risultati sò elencati cum'è riferimentu solu, i risultati effettivi di l'estrazione dipende da e condizioni di campioni.
L'estrazione di DNA di coaguli di sangue pò esse effettuata aduprendu i reagenti forniti in questi dui kit semplicemente cambiendu u protocolu per l'istruzzioni specifiche per l'estrazione di DNA di coaguli di sangue. A copia dolce di u protocolu di estrazione di DNA di coaguli di sangue pò esse rilasciata à a dumanda.
Suspende u campionu frescu cù 1 ml di PBS, soluzione salina normale o tampone TE. Omogeneizà cumpletamente u campione da un omogeneizzatore è raccoglie u precipitatu finu à u fondu di un tubu per centrifugazione. Eliminate u supernatante, è risuscite u precipitatu cù 200 μl buffer GA. A seguente purificazione di DNA pò esse realizata secondu l'istruzzioni.
Per a purificazione di gDNA in plasma, sieri è campioni di fluidi corporei, TIANamp Micro DNA Kit hè raccomandatu. Per a purificazione di u virus gDNA da campioni di siero / plasma, hè raccomandatu u TIANamp Virus DNA / RNA Kit. Per a purificazione di gDNA battericu da campioni di siero è plasma, si raccomanda TIANamp Bacteria DNA Kit (lisozima deve esse inclusa per batteri positivi). Per campioni di saliva, u Kit di DNA Hi-Swab è u Kit di DNA TIANamp Bacteria sò raccomandati.
U Kit vegetale DNAsecure o u Sistema vegetale DNAquick sò raccomandati per l'estrazione di u genomu fungicu. Per l'estrazione di u genomu di u lievitu, hè raccomandatu u TIANamp Yeast DNA Kit (a lyticase deve esse preparata da sè).
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AIV-H5 hè statu diluitu in 10-5-10-8gradienti cù acqua Mill-Q. U campionu 140 μl hè statu estrattu da u TIANamp Virus RNA Kit (DP315-R) è da u kit pertinente da u Fornitore A. Rispuntendu à u Fornitore A, TIANGEN hà prestazioni superiori per campione à bassa concentrazione.
Kit di rilevazione RT-qPCR: TIANGEN, FastKing One Step RT-qPCR kit (Sonda)
Strumentu RT-qPCR: Sistema PCR Veloce in tempu reale AB 7500.
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